4月18日，我校生命科學(xué)學(xué)院馬文福教授團(tuán)隊(duì)在 Acta Pharmaceutica Sinica B （ APSB ） 上在線發(fā)表了題為“ SARS-CoV-2 spike host cell surface exposure promoted by a COPI sorting inhibitor ”的研究論文，生命科學(xué)學(xué)院馬文福教授為通訊作者，2020級(jí)博士研究生李軼群、講師楊明銳博士和2021級(jí)博士研究生南亞楠為共同第一作者，北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院為第一單位。
該研究解析冠狀病毒S蛋白借助宿主COPI囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)及定位的分子機(jī)制，提供了以宿主成分COPI作為靶點(diǎn)的廣譜性藥物開發(fā)策略，設(shè)計(jì)的TAT-WDM多肽可作為抗冠狀病毒潛在藥物進(jìn)一步研究。而且，S蛋白的表面分布有利于抗體的Fc效應(yīng)器功能發(fā)揮，可考慮同時(shí)使用S蛋白表面促進(jìn)劑以增強(qiáng)疫苗和抗體的防治效果，為疫苗和抗體的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供參考。
文章基于冠狀病毒S蛋白結(jié)合COPI的結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)了一種能夠進(jìn)入細(xì)胞的低毒性COPI新型分選抑制多肽，證實(shí)了其具有促進(jìn)SARS-CoV-2 S蛋白細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)能力，并顯著增強(qiáng)了靶向S蛋白抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)（ADCC）。
通過解析冠狀病毒S蛋白內(nèi)三種分選信號(hào)KxHxx（SARS-CoV-2）、KxxHxx（HCoV-OC43）及Hxx（MHV）基序與COPI囊泡的β’-COP亞基復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，確定了冠狀病毒S蛋白與COPI間的保守相互作用模式，并與經(jīng)典COPI分選信號(hào)KKxx和KxKxx進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的KxHxx基序與β-propeller結(jié)構(gòu)域相互作用方式與KxKxx非常相似（圖1）。通過體外分子互作技術(shù)發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒S蛋白與COPI以較弱的親和力進(jìn)行相互作用，SARS-CoV-2的S蛋白滯留信號(hào)與COPI的解離常數(shù)高達(dá)1mM。較弱的相互作用特征適合作為靶點(diǎn)尋找潛在的分子抑制劑，獲得的結(jié)構(gòu)信息為設(shè)計(jì)與開發(fā)以COPI為靶點(diǎn)的廣譜抗冠狀病毒藥物提供了基礎(chǔ)。
圖1
團(tuán)隊(duì)以包含經(jīng)典Kxkxx基序的多肽為模板，設(shè)計(jì)了融合穿膜序列的TAT-WDM多肽，測(cè)試其與COPI的解離常數(shù)為1.8 μM，體外競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多肽能顯著抑制S蛋白與COPI的結(jié)合，且具有較好的細(xì)胞進(jìn)入能力和極低的細(xì)胞毒性。TAT-WDM作用于S蛋白穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，激光共聚焦顯微鏡下觀察膜表面S蛋白的熒光強(qiáng)度明顯升高（圖2A）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到雙熒光染色的細(xì)胞群數(shù)量顯著增多，達(dá)9%左右（圖2B）；通過生物素特異性親和凝膠富集膜表面生物素標(biāo)記蛋白，免疫印跡檢測(cè)富集到的生物素化S蛋白水平提高了1.5倍（圖2C-D）。TAT-WDM還能促進(jìn)S蛋白結(jié)合受體ACE2誘導(dǎo)的合胞體形成（圖2E-K）。值得注意的是，在構(gòu)建的體外ADCC實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，TAT-WDM作為COPI的分選抑制劑顯著的增強(qiáng)了靶向S蛋白的REGN10987抗體介導(dǎo)的人NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，且存在劑量依賴性。
圖2
而后，團(tuán)隊(duì)以TAT-WDM為研究工具，對(duì)SARS-CoV-2 Omicron突變株致病性改變的機(jī)制進(jìn)行了探究。以Alpha突變株B.1.1.7為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)Omicron BA.1毒株的S蛋白更強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)滯留能力。序列分析發(fā)現(xiàn)有32個(gè)突變位于Omicron BA.1 S蛋白的luminal區(qū)域，依次將BA.1的32個(gè)突變位點(diǎn)引入B.1.1.7的S蛋白，已構(gòu)建一系列嵌合表達(dá)載體并使用TAT-WDM處理，發(fā)現(xiàn)2個(gè)位于N端結(jié)構(gòu)域和1個(gè)位于受體結(jié)合區(qū)域的突變區(qū)域?qū)е翨A.1毒株S蛋白更強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留（圖3A-F）。而BIP及Calnexin（ER應(yīng)激標(biāo)志物）的檢測(cè)反映了關(guān)鍵突變位點(diǎn)導(dǎo)致S蛋白折疊缺陷影響胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)（圖3G-I），可能是Omicron S蛋白胞內(nèi)滯留及致病性改變的原因。
圖3
此論文全部研究系統(tǒng)均由研究團(tuán)隊(duì)依托生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)及細(xì)胞研究平臺(tái)構(gòu)建，借助上述系統(tǒng)，團(tuán)隊(duì)正在開展具有抗冠狀病毒及免疫調(diào)節(jié)作用的中醫(yī)藥篩選及研究工作。目前正在進(jìn)行麻杏石甘湯、痰熱清注射液、黃芩提取液、熊膽提取液及單體熊去氧膽酸、脫氧膽酸的藥效及機(jī)制研究。
Acta Pharmaceutica Sinica B（APSB）2011年創(chuàng)刊，由中國(guó)藥學(xué)會(huì)和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所共同主辦。JCR分區(qū)Q1區(qū)，位列全球279本Pharmacology & Pharmacy學(xué)科類期刊第8名。